差示掃描熒光法(Differential Scanning Fluorimetry，簡稱DSF)是一種先進(jìn)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析技術(shù)，近年來在生物科學(xué)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。本文將詳細(xì)介紹DSF的基本原理、實(shí)驗(yàn)過程、優(yōu)勢以及其在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析中的應(yīng)用，幫助讀者快速了解這一技術(shù)。
一、DSF的基本原理
DSF通過監(jiān)測蛋白質(zhì)在升溫過程中的熒光信號(hào)變化，來評(píng)估蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。其基本原理可以分為染料法DSF和無標(biāo)記DSF(Nano DSF)兩種。
染料法DSF：染料法DSF常用的是SYPRO Orange染料。SYPRO Orange是一種環(huán)境敏感的疏水染料，當(dāng)溫度升高時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊，疏水部分暴露出來，染料與蛋白質(zhì)的疏水部分特異性結(jié)合，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。通過監(jiān)測熒光強(qiáng)度的變化，可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的熔解溫度(Tm值)，即折疊蛋白與去折疊蛋白相等時(shí)的溫度。Tm值越高，表明蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越強(qiáng)。
無標(biāo)記DSF(Nano DSF)：無標(biāo)記DSF則是基于蛋白質(zhì)去折疊過程中色氨酸發(fā)射光譜的位移進(jìn)行檢測。通過檢測熒光變化，可以在非標(biāo)記環(huán)境下評(píng)估蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、膠體穩(wěn)定性、等溫穩(wěn)定性及變復(fù)性能力等性質(zhì)。
二、DSF的實(shí)驗(yàn)過程
DSF實(shí)驗(yàn)主要包括儀器準(zhǔn)備、樣品準(zhǔn)備、反應(yīng)體系配置、上機(jī)檢測和數(shù)據(jù)分析幾個(gè)步驟。
儀器準(zhǔn)備：DSF實(shí)驗(yàn)主要利用熒光定量PCR儀，在96孔或384孔PCR板上完成平行檢測，以實(shí)現(xiàn)高通量篩選目的蛋白和化合物。
樣品準(zhǔn)備：蛋白樣品需要具有較高的純度(約75%)，化合物的純度通過LC-MS質(zhì)檢。SYPRO Orange是目前DSF實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛的染料，此外，還有一些特殊的染料用于特定蛋白的研究，如1,8-ANS、2,6-ANS、2,6-TNS、oxazole系列和BODIPY、BFC系列染料探針。
反應(yīng)體系配置：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將蛋白和配體配置成不同濃度的體系，置于96孔板或384孔板中。反應(yīng)體系主要包括蛋白樣品、反應(yīng)緩沖液、熒光染料及候選的化合物配體，每檢測孔樣品體積為20~25?L，以蛋白緩沖液作為空白對(duì)照，每個(gè)檢測組設(shè)三組重復(fù)。
上機(jī)檢測：將配置好的體系放入熒光定量PCR儀中，激發(fā)和發(fā)射波長分別調(diào)至熒光染料相應(yīng)波長，升溫速率通常設(shè)為1℃/10s，溫度變化范圍一般從25℃到75℃或100℃，每1~3℃測定一次熒光強(qiáng)度(實(shí)驗(yàn)條件會(huì)根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化)。
數(shù)據(jù)分析：通過數(shù)據(jù)處理軟件，繪制出熒光強(qiáng)度隨溫度的變化曲線，通過擬合波爾茲曼(Boltzmann transport equation，BTE)方程，計(jì)算出蛋白樣品的Tm值及相關(guān)參數(shù)。
三、DSF的優(yōu)勢
DSF作為一種高效的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析技術(shù)，具有以下顯著優(yōu)勢：
無需標(biāo)記：Nano DSF無需使用熒光染料，直接檢測蛋白紫外熒光，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。
高通量篩選：DSF可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量蛋白樣品進(jìn)行穩(wěn)定性分析，提高了篩選效率。
低樣品消耗量：每個(gè)樣品僅需10~25?L，低濃度僅需0.5?g/mL，降低了實(shí)驗(yàn)成本。
數(shù)據(jù)精度高：DSF的數(shù)據(jù)精度高，Tm值的變異系數(shù)(CV)小于0.1%，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
溫度變化范圍廣：DSF的溫度變化范圍廣泛，從25℃到100℃不等，適用于不同熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)分析。
四、DSF在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析中的應(yīng)用
DSF在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，主要包括以下幾個(gè)方面：
蛋白質(zhì)穩(wěn)定性評(píng)估：DSF可以高通量測定蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定參數(shù)，評(píng)估突變、pH、離子強(qiáng)度等因素對(duì)熱穩(wěn)定性的影響，篩選出提高熱穩(wěn)定性的因素。這對(duì)于理解蛋白質(zhì)功能、預(yù)測蛋白質(zhì)行為具有重要意義。
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究：蛋白質(zhì)結(jié)晶是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要手段，DSF可以高通量篩選蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究提供有力支持。
蛋白質(zhì)-配體相互作用研究：配體與蛋白質(zhì)結(jié)合一般會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性改變，DSF可以通過測定蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性參數(shù)，評(píng)估配體與蛋白質(zhì)之間的相互作用，有助于揭示蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的功能機(jī)制。
藥物篩選與設(shè)計(jì)：DSF可用于評(píng)估藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，從而指導(dǎo)藥物篩選和設(shè)計(jì)。通過對(duì)化合物配體庫進(jìn)行高通量篩選，獲得與蛋白樣品相結(jié)合的候選化合物，評(píng)估化合物對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響，篩選出蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、抑制劑、輔助因子及分子伴侶。
疾病診斷與預(yù)防：DSF可用于檢測疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性變化，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病等，為疾病的早期診斷和預(yù)防提供有力工具。
五、總結(jié)
DSF作為一種高靈敏度的熱分析方法，在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力和應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，DSF將在生物科學(xué)研究、藥物研發(fā)以及疾病診斷和治療中發(fā)揮越來越重要的作用。通過優(yōu)化熒光探針和實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)一步提高DSF技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性，以更精確地評(píng)估蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，為揭示蛋白質(zhì)功能機(jī)制、指導(dǎo)藥物研發(fā)以及疾病診斷和治療提供有力支持。
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